使用蛋白質(zhì)沉淀和固相提取技術(shù)制備生物樣品

北京亙辰科技有限公司  Frank Han

介紹

利用LC-MS系統(tǒng)進(jìn)行微小分子的定量分析，需要從血清、血液、尿液、精液、脊髓液和其他離體樣品中去除無用的生物分子。主要是蛋白質(zhì)，因?yàn)榈鞍踪|(zhì)大分子容易變得粘稠并且可能堵塞色譜柱中的小孔。

色譜法

色譜法是生命科學(xué)研究中定量分析的標(biāo)準(zhǔn)分離技術(shù)。蛋白質(zhì)會(huì)破壞液相色譜或氣相色譜，血清中還含有稱為磷脂的其他脂肪酸衍生物，也較粘稠且會(huì)堵塞色譜柱。

Porvair Sciences開發(fā)出兩種類型的96孔板，可從體積高達(dá)2ml的血清樣品中去除蛋白質(zhì)，可解決蛋白質(zhì)在色譜柱中的問題。96孔P3板或蛋白沉淀板zui簡單有效、價(jià)格低廉；而C18 SPE板則更先進(jìn)，也更昂貴。

選擇何種孔板和方法取決于樣品，及所需的靈敏度和期望的分析值。

通常，在P3板上制備的樣品適合于標(biāo)準(zhǔn)LC-MS系統(tǒng)檢測，而在C18 SPE板上處理的樣品更適合于毛細(xì)管柱的高靈敏度QTOF和LC-MS分析。如果使用質(zhì)譜儀，則會(huì)出現(xiàn)磷脂和蛋白質(zhì)的污染問題。

LC-MS

 LC-MS是用于檢查血液或血清樣品中低濃度的類藥化合物和代謝物的一種常見技術(shù)。在低濃度時(shí)，磷脂問題突出，一組稱為溶血磷脂（去除更復(fù)雜）可導(dǎo)致檢測到的LC-MS信號的不一致。

離子抑制是由溶血磷脂引起的，其中由這些物質(zhì)誘導(dǎo)的高背景信號掩蓋由分析物產(chǎn)生的實(shí)際信號。離子抑制可以增加和減少分析物信號，使其難以校正。

蛋白沉淀技術(shù)

P3板在蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)中能有效去除蛋白質(zhì)，但不能成功去除磷脂和溶血磷脂。使用乙腈或甲醇使蛋白質(zhì)變性。蛋白質(zhì)從溶液中“沉淀”并集結(jié)成大的粘性球體，直到使用真空將含有所需分析物的液體推進(jìn)過濾器，zui后進(jìn)入收集板。

固相萃取

固相萃取（SPE）是一種傳統(tǒng)技術(shù)，使用P3板需要額外的調(diào)節(jié)和清潔過程，耗時(shí)且更難自動(dòng)化。而C18二氧化硅能夠從樣品中去除幾乎所有的磷脂。本文檢測了用于去除磷脂的不同材料的適用性，標(biāo)準(zhǔn)C18硅膠與兩種不同的樹脂進(jìn)行比較。

評估C18硅膠板去除磷脂

使分析物容易通過，在吸附劑上保留磷脂。分別用HPLC和比色法測定分析物和磷脂的濃度。陽離子交換混合模式樹脂可用作吸附劑：

樹脂1

A  PCX樹脂，混合陽離子交換樹脂，用于初始測試組。使用磷脂酰膽堿標(biāo)準(zhǔn)物來評估磷脂的去除。傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)沉淀和PCX樹脂與P3的雜合物的比較，中性，酸性和堿性甲醇作為沉淀溶劑。

結(jié)果表明，傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)沉淀不能去除任何磷脂，而當(dāng)與酸性或中性有機(jī)溶劑一起使用時(shí)，PCX樹脂能去除大于90％的磷脂。

樹脂2

使用酸性，中性和堿改性的有機(jī)溶劑檢查PRP X400樹脂的磷脂保留。

鑒于PRP樹脂是用磺酸鹽基團(tuán)改性的二乙烯基苯，其去除磷脂的性能極差。

結(jié)果表明，選擇適當(dāng)?shù)仃栯x子交換樹脂，可以很好的去除磷脂。相互作用在約75％有機(jī)溶劑產(chǎn)生3:1蛋白質(zhì)沉淀。基于C18二氧化硅足夠的吸附性， P3板有良好的磷脂保留。

初始研究C18的磷脂去除

實(shí)驗(yàn)1

將600μl的甲醇中混入1mg / ml磷脂酰膽堿并加入到入C18微孔板的孔中，加入200μl蒸餾水，并使用Porvair Sciences的真空歧管在真空下將混合物抽吸通過C18層。使用Porvair Sciences Miniivap氮?dú)飧稍镎臼占⒄舭l(fā)濾液，然后在600μl chloroform中重構(gòu)，做磷脂測試。

結(jié)果表明，甲醇與水的比例為3：1，可以去除約90％的磷脂。再用acetonitrile代替甲醇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明沒有保留磷脂。選擇合適的板去除磷脂至關(guān)重要。

實(shí)驗(yàn)2（從豬血漿中除去磷脂）

通過將200μl血漿注射到600μl甲醇中制備6個(gè)豬血漿樣品。然后將這些樣品離心以除去沉淀的蛋白質(zhì)，并收集上清液。

使用Minivap將所有樣品在氮?dú)庀抡舭l(fā)，并在600μl chloroform中重建，用于磷脂檢測。對于兩種C18，磷脂的濃度降至低于10μg/ ml的檢測極限。

實(shí)驗(yàn)3（分析物回收）

使用三種皮質(zhì)類固醇，即潑尼松龍，皮質(zhì)酮和地塞米松，來評價(jià)分析物的回收率。然后在75％水/甲醇中制備20μg/ ml的皮質(zhì)類固醇的溶液。將1ml的分析物溶液通過C18過濾，收集濾液并使用HPLC檢查濾液。

結(jié)論

上述所有實(shí)驗(yàn)表明，使用C18樹脂是去除磷脂的可行方法。典型的3:1甲醇與血漿的沉淀比可除去大部分磷脂，同時(shí)大多數(shù)分析物容易通過。研究表明，C18吸附劑和P3組合可以提供一種合適的去除磷脂的方法，但是需要更多的研究來確定從這些樣品中去除溶血磷脂。